تولید رده سلولی K562 بیان کننده اندونوکلئاز Cas9 (CRISPR-associated9)
نویسندگان
چکیده مقاله:
چکیده سابقه و هدف امروزه ژنوم رده‌های سلولی به منظور ایجاد مدل‌های بیماری و درمان آنها ویرایش می‌شود. البته بزرگی ژن Cas9 موجب مشکلاتی از جمله پایین بودن کارآیی سیستم CRISPR شده است. برای حل این مشکل، رده‌های سلولی بیان‌کننده Cas9 تولید شده‌اند که در آنها تنها باید بخش RNA راهنمای CRISPR به سلول ترانسفکت شود. مواد و روش‌ها در این مطالعه تجربی، قطعه PGK-PURO/CMV (PPC) با PCR از وکتور pAAVS1-puro-DNR تکثیر شده و در وکتور pTG19-Tهمسانه‌سازی شد. سپس قطعه PPC از این وکتور با آنزیم‌های KpnI و EcoRI خارج شد. وکتور pCas-Guide-AAVS1 نیز تحت برش آنزیمی مشابه قرار گرفت و اتصال آن با قطعه PPC منجر به ساخت وکتور pPPC-Cas گردید. پس از بهینه کردن شرایط الکتروپوریشن، وکتور pPPC-Cas به درون سلول‌های K562 الکتروپوریت شد و سلول‌های مقاوم به پرومایسین انتخاب شدند و میزان بیان Cas9 در آنها با Real-time PCR بررسی شد. یافته‌ها با PCR قطعه‌ای به طول 2514 جفت باز تکثیر شد. وکتورpPPC-Cas طی دو مرحله همسانه‌سازی ساخته شد. سلول‌های ترانسفکت شده مقاوم به پرومایسین انتخاب شدند. انتخاب کلونی در ادامه انجام شد و سه کلونی که نسبت به هم بیان‌های بالا، متوسط و پایین داشتند، انتخاب شدند. نتیجه گیری در این مطالعه سلول‌های K562 بیان‌کننده Cas9 به دست آمدند که از آنها می‌توان در مطالعه‌های آتی‌ژنومیک عملکردی و نیز تولید مدل‌های سلولی بیماری‌های انسانی استفاده کرد.
منابع مشابه
استفاده از سیستم CRISPR/Cas9 برای دستکاری ژن SGR فستوکای بلند بر اساس بیان موقت
چکیده سابقه و هدف: یکی از فناوری های پیشرفته در ویرایش ژنوم، مربوط به فناوری تکرارهای کوتاه پالیندرومی فاصله دار منظم خوشه ای است. در این پژوهش RNA راهنمای مربوط به ژن SGR درگیر در تجزیه کلروفیل، در تماس نزدیک با پروتئین Cas9 در سازه CRISPR برای هدف قرار دهی این ژن در برگ های فستوکای بلند قرار گرفت. مواد و روش‌ها: در راستای ساخت سازه CRISPR/Cas9 قابل برنامه ریزی برای هدف گیری ژن SGR، ابتدا یک...
متن کاملCRISPR/Cas9: ابزار قدرتمند مولکولی برای ویرایش ژنوم
اصلاح هدفمند ژنومی با استفاده از نوکلئازهای هدایت شونده توسط RNA روشی سریع، آسان و پربازده است که نه تنها امکان دستکاری و تغییر ژنها و مطالعات کارکردی را برای پژوهشگران فراهم نموده است، بلکه آگاهی آنها را در رابطه با اساس مولکولی بیماریها و ابداع روشهای درمانی نوین و هدفمند افزایش داده است. تاکنون فنون متفاوتی با عنوان قیچیهای مولکولی با قابلیت ویرایش هدفمند ژنوم شاملZFN ،TALEN وCRISPR/Ca...
متن کاملWhat is CRISPR/Cas9?
HYMS Centre for Education Development (CED), Hull York Medical School, University of York, York, UK Molecular Haematology Unit, MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, University of Oxford, John Radcliffe Hospital, Oxford, UK Department of Haematology, Oxford University NHS Foundation Trust, Churchill Hospital, Oxford, UK Academic Unit of Child Health, Sheffield Children’s Hospital, She...
متن کاملOverview of CRISPR-Cas9 Biology.
Prokaryotes use diverse strategies to improve fitness in the face of different environmental threats and stresses, including those posed by mobile genetic elements (e.g., bacteriophages and plasmids). To defend against these elements, many bacteria and archaea use elegant, RNA-directed, nucleic acid-targeting adaptive restriction machineries called CRISPR -: Cas (CRISPR-associated) systems. Whi...
متن کاملCRISPR-Cas9: Prospects and Challenges.
All science takes inspiration from nature, but nowhere is this more true than in biology, where some of the most powerful tools available to researchers are derived from natural products. From restriction enzymes and fluorescent proteins to microbial opsins and viral gene delivery vectors, researchers have capitalized on processes that occur in a variety of microbial, plant, and animal species....
متن کاملمهندسی ژنوم از آزمایشگاه تا بالین توسط CRISPR/Cas9
اکتشاف قیچیهای مولکولی به همراه توانایی آنها در ایجاد تغییرات هدفمند در نقاط مشخصی از ژنوم، به بررسیهای کارکردی ژنها، ژنوم و اپیژنوم منجر شده است. این فنون با افزایش فهم پژوهشگران در رابطه با اساس مولکولی بیماریها و تسهیل درمانهای نوین ژنتیکی کمک شایانی به علم ژنتیک پزشکی کرده است. سادگی سیستم CRISPR/Cas9، دستورزی راحت و قابلیت هدفگیری چندگانه، CRISPR/Cas9 را به عنوان سیستم منتخب در بسی...
متن کاملمنابع من
با ذخیره ی این منبع در منابع من، دسترسی به آن را برای استفاده های بعدی آسان تر کنید
ذخیره در منابع من قبلا به منابع من ذحیره شده{@ msg_add @}
عنوان ژورنال
دوره 16 شماره 1
صفحات 32- 43
تاریخ انتشار 2019-02
با دنبال کردن یک ژورنال هنگامی که شماره جدید این ژورنال منتشر می شود به شما از طریق ایمیل اطلاع داده می شود.
کلمات کلیدی برای این مقاله ارائه نشده است
میزبانی شده توسط پلتفرم ابری doprax.com
copyright © 2015-2023